流通池汙染怎麼沖洗

1.用HPLC進行分析時保留時間有時發生漂移，有時發生快速變化，原因何在？如何解決？

關於漂移問題：

① 溫度控制不好，解決方法是採用恆溫裝置，保持柱溫恆定

② 流動相發生變化，解決辦法是防止流動相發生蒸發、反應等

③ 柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡

關於快速變化問題

① 流速發生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩定

② 泵中有氣泡，可透過排氣等操作將氣泡趕出。

③ 流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內進行適當混合

2.液相色譜中峰出現拖尾或出現雙峰的原因是什麼？

① 篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。

② 存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子

③ 可能柱超載，減少進樣量。

3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

① 樣品量不足，解決辦法為增加樣品量

② 樣品未從柱子中流出。可根據樣品的化學性質改變流動相或柱子

③ 樣品與檢測器不匹配。根據樣品化學性質調整波長或改換檢測器

④ 檢測器衰減太多。調整衰減即可。

⑤ 檢測器時間常數太大。解決辦法為降低時間引數

⑥ 檢測器池窗汙染。解決辦法為清洗池窗。

⑦ 檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。

⑧ 記錄儀測壓範圍不當。調整電壓範圍即可。

⑨ 流動相流量不合適。調整流速即可。

⑩ 檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

4.做HPLC分析時，柱壓不穩定，原因何在？如何解決？

① 泵內有空氣，解決的辦法是清除泵內空氣，對溶劑進行脫氣處理；

② 比例閥失效，更換比例閥即可；

③ 泵密封墊損壞，更換密封墊即可；

④ 溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法；

⑤ 系統檢漏，找出漏點，密封即可；

⑥ 梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

5.我最近更換了另一種牌號的ODS柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不能重現，為什麼？

這是因為被分析物可能具有形成氫鍵的能力。儘管過去幾年來，填料的製造技術有了極大的提高，但不同的廠商的ODS填料表面矽醇基的濃度不同。正是這些矽醇基可能與樣品發生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號的ODS柱上的相對保留時間就可能不同。在流動相中加入少量競爭物，如三乙基胺（TEA），將會使矽醇基的成鍵能力飽和，從而能保證不同牌號柱子上的相對保留時間具有較好的重現性。

如分離情況可以，系統穩定，達到系統適用性要求，就不必保留時間的重現。

6.我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什麼？

柱壓過高是HPLC柱使用者最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常並不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。

① 拆去保護預柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；

② 把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查；

③ 將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連線檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；只用於使用過的柱子。

④ 更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質，正是這些雜質將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯絡。一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個線上過濾器便可避免柱壓過高的問題，SGE提供的Rheodyne 7315型過濾器就是解決這一問題的最佳選擇。

7.色譜雙峰產生的可能及判斷和處理

HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下（不包括梯度），峰型應對稱而尖銳。但是，在對樣品瞭解程度不夠，方法不妥，樣品處理方法及進樣方式不合理下，會出現各種意想不到的問題，而對色譜峰難以作出合理的解釋，尤其對於新手更是如此。下面根據本人幾年工作的體會，提出一些看法，向同仁指教。

色譜雙峰指的是明是一種物質，但在色譜圖中出現雙峰，而表明含二種物質。我將這種情況分為四種原因。

1 色譜柱

如果你分析樣品時發現每個色譜峰都雙峰出現（出峰越快，雙峰的可能性會減少），尤其採用單一純物質時，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變髒或流失。如果進樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當然不反衝，正衝有時也會正常的。如果峰拖尾，雙峰強弱相差不大，柱頭固定相變髒或流失可能性更大，這是可以將進樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭颳去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術，同時不能老幹那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會應柱效很低而報廢。

2 溶劑極性及進樣量

許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方面的內容，而這確是雙峰產生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水，加各種新增劑以改善分離效能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動相溶解，但是很多情況是不一致的。當用溶劑極性強度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣），且拖尾，保留時間會提前（相對進樣量少而言），將進樣量減少一半以上，峰型將變為正常。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大，而流動相來不及將其稀釋達到平衡造成的。上面提到進樣量造成雙峰的一個原因，另一個原因是，進樣量不一定大，但絕對量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由於進樣量過大，色譜柱過載造成的。

3 樣品的特性

有些樣品由於其化學結構的特點，存在互變異構現象，而這種互變異構體無法分開，而是以一個動態平衡存在。在色譜分析時，在一個特定的條件下，一種物質將出現雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現象將消失，如紅黴素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質譜檢測器，其質譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農藥啶蟲眯（吡蟲清）。

4 引數

記錄的引數一般都內定的，不必修改，但GC和HPLC的引數是不完全一致的，例如C－R3A資料記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC

為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變為二個峰或更多。

8.色譜柱中的流動相會排幹嗎？

不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸乾了，HPLC系統由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動相都排幹了？色譜柱還能使用嗎？事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸乾，並不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。

相比之下，另一個更可能發生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太鬆而使色譜柱變幹。同樣，整個色譜柱乾涸的情況不太容易發生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變幹了，因揮發掉所有溶劑是色譜柱變幹需要相當長的時間。即使色譜柱真的變幹了，也不一定就不可救藥了。可以嘗試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助於浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應該能夠溶解並去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）衝一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復到正常狀態。

9.使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接頭需要注意什麼問題？

如果經常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料製成的管路和接頭會非常方便。PEEK管路容易連線；PEEK接頭不僅無需工具，手擰即可固定，而且容易調節錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規格的色譜柱相連線。

使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對滷代烷烴和四氫呋喃的相容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會變脆。另一個西藥考慮的因素是壓力限。不鏽鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多數HPLC應用系統壓力不會超過3000psi）。

使用PEEK接頭時則無需擔心接頭耐溶劑效能，因為接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手擰固定的PEEK接頭壓力限低於不鏽鋼管，因而壓力太高時，可能會使接頭在管路上滑動而產生死體積或漏液。

10. 液相色譜梯度洗脫中柱溫的影響

許多色譜工作者在操作液相色譜時，色譜柱是在室溫環境下工作的。如果實驗室的溫度能保持不變的話，不會有什麼大問題。但大多數的工作環境溫度是不斷變化的，因此若想將在某實驗室開發的一種液相色譜方法應用到其他實驗室的話，溫度的差別就會引起較複雜的問題。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，本文就來討論液相色譜方法中的梯度洗脫方式受溫度影響的問題。

等度保留

大多數色譜工作者知道等度洗脫時溫度會影響保留時間。圖1顯示了三個不同溫度下的分離結果。我們發現當溫度升高時所有的色譜峰都前移了，等度洗脫時一般溫度每升高一攝氏度保留時間會縮短1-3%，在圖1中，保留時間變化率約為2%/℃。

擁有溫控系統的實驗室一般都有全天候溫控設定，但這種設定可能引起室溫顯著變化，這對整夜執行的色譜系統就會有一些影響，例如我們實驗室的夜間溫度就設為4-7℃。在不同的季節，實驗室的夜間溫度可能比正常工作日的溫度高或低，這種溫度的變化就會使色譜峰離開“保留時間窗”，造成連續進樣中產生一系列的無效資料。

還有一個可能的溫度影響因素就是色譜儀器在實驗室的位置。當色譜柱正對著空調的送風口時，雖然整個實驗室的溫度非常穩定，但色譜系統的溫度就會不斷的變化。這就是我們要使用柱溫箱的原因之一。

梯度保留

溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的。圖2是苯胺和苯酸在三個溫度條件下的色譜圖。圖1中，20℃的溫度變化引起保留因子的變化大約為兩倍，然而在圖2中，40℃的變化使保留改變了約20%。平均來說，圖2中的色譜保留變化約為0。2%/℃。由此可見，溫度變化對梯度洗脫的影響要小於對等度洗脫的影響（假定本例具有普遍代表意義）。即便如此，若梯度洗脫時不控制溫度的話，保留值一般都會有較大的變化。

選擇性的變化

比較圖1和圖2會發現溫度變化能引起選擇性顯著變化。圖1中，25℃時第二個峰和第一個峰很接近，但當溫度升高後，第二個峰卻遠離第一個峰，接近第三個峰。從三個圖來看，對於前三個峰的最佳分離條件是35℃。值得注意的一個有趣現象是，選擇性的變化是和成分相關的，例如圖1中當溫度變化後最後三個峰的相對位置幾乎不變。

在圖2的梯度洗脫示例中，也有選擇性變化。峰1、2、4和5的相對位置沒有十分明顯的變化，但是，當溫度升高時，峰3會移近峰4。

峰位置的相對變化和溫度的變化是有規律可循的。當條件確定以後，這個規律就是可預測的。例如，在圖2中當溫度升至77℃以上時，峰3和峰4將會合並。而當溫度更高時，峰3將會移到峰4之後。溫度引起的選擇性變化的多年來一直未受重視。最近，施耐德等人發現能夠將溫度作為一個調整選擇性的有力工具。圖1中的樣品在35℃時可以達到最佳選擇性（峰之間的距離最大），而圖2中的樣品在38℃時可達到最佳選擇性（這兩份樣品的最優溫度近似純屬巧合）。

溫度控制

從實踐出發，圖1和2的例子說明為了獲得一致的結果我們必須要控制柱溫，使用柱溫箱是最好的辦法。目前商業化的柱溫箱有兩種形式：直接加熱色譜柱和透過空氣傳熱，每種設計都有其優缺點，而且不同廠商設計的LC系統也有不同的限制。在直接加熱型柱溫箱中色譜柱是被夾在金屬加熱器中或被加熱器包裹起來；而在空氣傳熱型的柱溫箱和氣相色譜柱溫箱很相像，色譜柱是被懸掛在靜止或流動的空氣中，透過加熱空氣來保持柱溫。第三種設計是把色譜柱浸在液體中（比如水浴中），這在實驗室中很容易搭建，但通常這種設計也並不比其他設計省力。

如果沒有柱溫箱，最有效的辦法就是將色譜柱隔絕在一個溫度波動最小的地方。例如，可把色譜柱置於泡沫塑膠套中或色譜包裝盒中，當實驗室溫度基本不變時效果很好，但這種方法必須要允許保留有一些波動。隔絕色譜柱也可以避免結果受環境溫度影響。

溫度平衡

我們知道，為了保證分離的重現性，色譜柱在梯度洗脫狀態下的必須有平衡過程。當一次梯度洗脫分離完成後，一定要用10-15倍柱體積的流動相來沖洗柱子以恢復柱子的平衡。例如，如果使用B溶劑5-100%的梯度，柱子為150mm´4。6mm（柱體積為1。5ml），當流動相從100%的B溶劑換回到5%的B溶劑時，大概需要保持1。5ml/min的流速10分鐘來恢復系統平衡，在進行下一次梯度變換之前如果系統沒有平衡，那麼保留時間的重現性就會很差。

正如柱子不能完全平衡將導致保留時間的重現性差一樣，柱溫不平衡也會導致不理想的後果，這個問題在峰寬上的影響尤其明顯。當溫度變化時除了選擇性和保留時間的變化之外，峰寬也會發生變化。升高溫度通常會使理論塔板數（N）升高，峰寬變窄，由於峰面積不變，峰越窄就會越高，因此升高溫度可以達到更小的檢測限。（這篇文章裡的色譜圖不是按同一個y軸比例來畫的，所以峰高的變化沒有表示出來）

不用平衡的流動相充分的沖洗柱子會導致化學不平衡狀態，但是當柱子在程序升溫的環境中我們怎樣確定不平衡問題呢？答案取決於柱子中的流動相，如果柱子是在室溫條件下，溶劑瓶、泵和自動進樣器也在室溫下，那麼整個系統中的溫度就應該是穩定的。但是，如果柱子是熱的，系統的其他部分和溶劑是室溫，柱頭將比柱尾涼。柱子裡的溫度變化將會影響峰形。

圖3所示色譜圖中柱溫為38℃，進柱的溶劑為室溫（約22℃），最後一個峰有很明顯的變形。把溶劑瓶、泵、自動進樣器加熱至與柱溫相同是不現實的，所以溶劑預熱器是最好的選擇。我們用1米長，0。25mm內徑的不鏽鋼管作為預熱器，把這個不鏽鋼管盤成直徑大約10cm的平面緊貼在柱溫箱裡的預熱器上，再讓流路垂直以便預熱器能夠位於自動進樣器和柱子之間，這樣，涼的溶劑從自動進樣器裡出來到柱子之前經過這個預熱盤升高了溫度。圖3中的上面一個色譜圖就是增加了預熱器使峰形得到改善。有一些商品柱溫箱就包括這個預熱器。

當流動相和柱子之間的溫差增大時，由溫度不平衡而導致的峰變形就會加劇。比較圖3-5你會發現這個問題很富戲劇性。在77℃時後一個峰變形很大以至於會認為它是兩個成份或者認為柱子有了死體積。在上述情況下當使用了預熱盤以後峰型都變得很漂亮。雖然由於比例不同我們無法看出，其實圖3-5中所有對應成份的峰面積都是不變的。

為什麼會看到這些峰變形了呢？這很容易從峰展寬的角度來解釋。前段的溫度比尾部的溫度高，所以前段走的快。當前面比後面走的快的時候就會產生展寬的峰。這種現象和梯度洗脫中有種情況是相對的，就是在一開始使用弱極性溶劑小流速後用強極性大流速。雖然使用預熱器來改善峰形是一個很著名的結論（見參考文獻3）但峰變形的原因仍然很複雜。在理想梯度洗脫中，每個峰都應該在相同的環境中出來而且以相同的速度透過柱子，最後得到相同的峰寬。但是很奇怪後出的峰變形問題比先出的峰要嚴重，正如圖4所示。或許讀者對這個現象會有簡單的解釋。

結論

我們發現柱溫在液相色譜梯度洗脫過程中扮演了一個重要的角色，首先，提高柱溫可以縮短保留時間，其次，我們看到柱溫還可以影響選擇性，最後，溫度的不平衡會導致峰扭曲變形。這些提醒我們，如果想得到穩定可靠的分離結果，色譜柱的溫度變化是不可忽視的。

11.為何會基線漂移

原因

① 柱溫波動。（即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。）

②流動相不均勻。（流動相條件變化引起的基線漂移大於溫度導致的漂移。）

③流通池被汙染或有氣體

④檢測器出口阻塞。（高壓造成流通池視窗破裂，產生噪音基線）

⑤流動相配比不當或流速變化

⑥柱平衡慢，特別是流動相發生變化時

⑦流動相汙染、變質或由低品質溶劑配成

⑧樣品中有強保留的物質（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現出一個逐步升高的基線。

⑨使用迴圈溶劑，不提倡。未調整檢測器。

⑩檢測器沒有設定在最大吸收波長處。

解決方法

①控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器

②使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和新增劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用線上脫氣或氦氣脫氣。

③用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸）

④取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。

⑤更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

⑥用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。使用離子對試劑、緩衝鹽更應注意平衡柱。

⑦檢查流動相的組成。使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑

⑧改變分析條件。使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。

⑨重新設定基線。使用新的流動相。

⑩將波長調整至最大吸收波長處。重選檢測波長。

12.規則的基線噪音是如何產生的

原因

①在流動相、檢測器或泵中有空氣（尖銳峰）

②漏液 。

③流動相混合不完全 。

④溫度影響（柱溫過高，檢測器未加熱）

⑤在同一條線上有其他電子裝置（偶然噪聲）

⑥泵振動 。

解決方法

①流動相脫氣。沖洗系統以除去檢測器或泵中的空氣。

②檢查管路接頭是否鬆動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。

③用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑

④減少差異或加上熱交換器

⑤斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自於外部，加以更正。 採用精密級穩壓電源。

⑥在系統中加入脈衝阻尼器

13.不規則的基線噪音是如何產生的

原因

①漏液。

②流動相汙染、變質或由低質溶劑配成

③流動相各溶劑不相溶

④檢測器/記錄儀電子元件的問題

⑤系統內有氣泡

⑥檢測器內有氣泡

⑦流通池汙染（即使是極少的汙染物也會產生噪音。）

⑧檢測器燈能量不足

⑨色譜柱填料流失或阻塞

⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常

解決方法

①檢查接頭是否鬆動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。

②檢查流動相的組成。

③選擇互溶的流動相

④斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查並更正。

⑤用強極性溶液清洗系統

⑥清洗檢測器，在檢測器後面安裝背景壓力調節器

⑦用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池

⑧更換燈

⑨更換色譜柱

⑩維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置

14.保留時間漂移的故障排除

保留時間不重現有兩種不同的情況：既保留時間漂移和保留時間波動。前者是指保留時間僅沿單方向發生變化，而後者指保留時間無固定規律的波動。將此兩種情況區分開來對找到問題的原因往往很有幫助。如，保留時間的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留時間的無規律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機理的色譜柱老化，如固定相流失（例如透過水解），色譜柱汙染（由樣品或流動相所致）等。保留時間漂移的幾種最常見的原因如下：

一 色譜柱平衡

如果我們觀察到保留時間漂移，首先應考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10-20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量新增劑（如離子對試劑）則需要相當長的時間來平衡色譜柱。

流動相汙染也可能是原因之一。溶於流動相中的少量汙染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應注意：水是很容易汙染的流動相成分。

二 固定相穩定性

固定相的穩定性都是有限的，即使在推薦的PH範圍內使用，固定相也會慢慢水解。例如，矽膠基質在pH4時水解穩定性最好。水解速度與流動相型別和配體有關。雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩定；長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩定的多。

經常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他矽膠基質鍵合相在水溶液環境中也可以發生水解，如氨基鍵合相等。

三 色譜柱汙染

保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱汙染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾並吸附流動相攜帶的任何物質。汙染源可以是：流動相本身，流動相容器，連線管、泵、進樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常透過實驗可判斷汙染的來源。

樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質。如：配藥中的賦形劑，生化樣品（如血清）中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的澱粉，環境水樣中的腐殖酸等。通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其後會有反壓的增加。可以透過使用固相提取（SPE）等樣品前處理方法來去除樣品基質的影響。

避免色譜柱汙染最簡單的方法是防患於未然。相比之下，找到問題的所在並設計有效的清洗步驟以去除汙染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑，但並非所有汙染物都可以在流動相中溶解。如THF可去除反相色譜柱中的許多汙染物，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用於去除反相色譜柱中的蛋白。

使用保護柱是個非常有效的方法。反衝色譜柱僅是不得已時採用的辦法。

四 流動相組成

流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發組分的揮發及迴圈使用流動相等。

五 疏水坍塌

當小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發生分離突然喪失及被分析物質保留明顯降低或完全不保留的現象，這就是疏水坍塌。此現象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實現用含大量有機組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進行平衡。色譜柱長期儲存也會發生此現象。使用內嵌極性基團的反相色譜柱（如Waters SymmetryShield RP色譜柱）或非端基封口的色譜柱（如Waters Resolve色譜柱）也可避免發生坍塌。

（一）保留時間變化

①柱溫變化－－柱恆溫

②等度與梯度間未能充分平衡－－至少用10倍柱體積的流動相平衡柱

③緩衝液容量不夠－－用>25mmol/L的緩衝液

④柱汙染－－每天沖洗柱

⑤柱內條件變化－－穩定進樣條件，調節流動相

⑥柱快達到壽命－－採用保護柱

（二）保留時間縮短

①流速增加－－檢查泵，重新設定流速

②樣品超載－－降低樣品量

③鍵合相流失－－流動相PH值保持在3~7。5；檢查柱的方向

④流動相組成變化－－防止流動相蒸發或沉澱

⑤溫度增加－－柱恆溫

（三） 保留時間延長

①流速下降－－管路洩漏，更換泵密封圈，排除泵內氣泡

②矽膠柱上活性點變化－－用流動相改性劑，如加三乙胺，或採用鹼至鈍化柱

③鍵合相流失－－ 同前（二）3

④流動相組成變化－－同前（二）4

⑤溫度降低－－同前（二）5

15.為何出現肩峰或分叉？

①樣品體積過大－－用流動相配樣，總的樣品體積小於第一峰的15%

②樣品溶劑過強－－採用較弱的樣品溶劑

③柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱，採用較弱腐蝕性條件

④柱內燒結不鏽鋼失效－－更換燒結不鏽鋼，加線上過濾器，過濾樣品

⑤進樣器損壞－－更換進樣器轉子

16.為何出現鬼峰？

①進樣閥殘餘峰－－每次用後用強溶劑清洗閥，改進閥和樣品的清洗

②樣品中未知物－－處理樣品

③柱未平衡－－重新平衡柱，用流動相作樣品溶劑（尤其是離子對色譜）

④三氟乙酸（TFA）氧化－－每天新配，用抗氧化劑

⑤水汙染（反相）－－透過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水

17.為何出現峰拖尾？

①柱超載－－降低樣品量，增加柱直徑採用較高容量的固定相

②峰干擾－－清潔樣品，調整流動相

③矽羥基作用－－加三乙胺，用鹼致鈍化柱，增加緩衝液或鹽的濃度降低流動相PH值，純化樣品

④柱內燒結不鏽鋼失效－－更換燒結不鏽鋼，加線上過濾器，過濾樣品

⑤柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱，採用較弱腐蝕性條件

⑥死體積或柱外體積過大－－連線點降至最低，對所有連線點作合適調整，儘可能採用細內徑的連線管

⑦柱效下降－－用較低腐蝕條件，更換柱，採用保護柱

18.為何出現峰展寬？

①樣品體積過大－－用流動相配樣，總的樣品體積小於第一峰的15%

②在進樣閥中造成峰擴充套件－－進樣前後排出氣泡以降低擴散

③資料系統取樣速率太慢－－設定速率應是每峰大於10點

④檢測器時間常數過大－－設定時間常數為感興趣第一峰半寬的10%

⑤流動相粘度過高－－增加柱溫，採用低粘度流動相

⑥檢測池體積過大－－用小體積池，卸下熱交換器

⑦保留時間過長－－等度洗脫時增加強溶劑含量，也可用梯度洗脫

⑧柱外體積過大－－將連線管徑和連線管長度降至最小

⑨樣品過載－－進小濃度小體積樣品

19.除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變？

改變流動相組成和溫度；改變柱長、柱內徑和填料粒度；柱突然阻塞壓力升高（正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的）。

20.什麼是強溶劑、弱溶劑？

改變流動相的組成或溶劑溶劑強度就可以改變峰容量因子和保留時間。在一定條件下，減少保留時間或縮短分析時間的溶劑為強溶劑，增加保留時間或延長分析時間的溶劑為弱溶劑。

21.怎樣才會使峰位發生重排？

在分析多組分樣品時，僅改變流動相的強度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時間，不會發生峰位的重排。

下列條件改變可能發生峰位重排：流動相中換了強溶劑；PH值的改變；柱填料的改變；柱溫的改變；流動相的組成改變（如加入離子對試劑三乙基胺等）。

22.除了線上脫氣，常用的實驗室脫氣方式還有哪些？

加熱迴流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次於氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實驗室中最常用。目前還是儘量爭取用線上脫氣，方便且效果好。

23.評價一個色譜柱的最基本指標有

那些

？

評介一根色譜柱的基本指標是：塔板數、峰不對稱因子、柱壓降、適用範圍和鍵合相濃度以及峰容量。

24.什麼是時間常數？

時間常數實際上是響應時間的設定，起著過濾噪音的作用。時間常數太小（太快）可能增加短噪音，時間常數太大（太慢）可能出寬峰、拖尾峰。

25.為什麼在實驗過程中有時會出現倒峰？

所用的流動相在檢測波長下有吸收，而進在此波長下沒有吸收或吸收低於流動相的溶液，在流動相中會出現洞穴，透過柱後出現倒峰。

26.為何會出現“胖”峰和平頭峰？怎樣避免？

用比流動相強度大的大體積樣品進樣，通常會損害色譜圖的質量，而出現“胖”峰和平頭峰。應遵循下列規則選用溶劑溶解樣品：A最好用流動相溶解樣品進樣。B用大體積弱溶劑溶解樣品，如反相色譜中用水溶解樣品進樣，主要缺點是每次進樣後在色譜圖的開頭出現大的負峰，有時還波及到樣品峰。C需要時用強溶劑溶解進樣。

27.什麼是次級保留效應？

在良好的色譜分離中，樣品分子是以單一的保留過程被保留。如在反相色譜中，溶質與柱填料的非極性烷基鏈發生疏水性相互作用。但在以矽膠為基質的填料中，有些樣品組分能與矽醇基團相互作用，脫附的過程很慢，使峰嚴重拖尾，這就是次保留過程。對付次保留效應最有效的方法就是選用封尾更好色譜柱或加入流動相改良劑（也叫掃尾劑）。

28.前延峰的發生及處理？

因柱溫問題很易引起前延峰，有些樣品在常溫下分離可見前延峰，提高溫度後前延峰的現象消失。在離子對色譜中，前延峰的另一個原因是用非流動相作樣品溶劑。因此在離子對色譜中要求僅用流動相溶解樣品，而且進樣量不要太大，否則會導致前延峰或其它問題。在RP-HPLC中樣品溶液的強度大於流動相引起前延峰。增加流動相的強度，減少樣品溶液的強度，在離子對色譜中增加離子強度，可以克服前延峰的效應。此外使用流動相溶解樣品是解決的最簡單實用的方法。

29.峰變寬的原因？

A在使用過程中柱本身退化，逐漸降低柱效。B柱外峰寬效應。一根很好的專用柱用於另一液相色譜系統引起塔板數降低，說明新系統有很大的柱外峰寬效應。C化學效應，多數是流動相和固定相相互作用所致，改變流動相可使寬峰有所改善。

30.柱平衡慢的常見原因有哪些？

柱平衡慢的常見原因是，組分在舊的或新的流動相中對柱吸附強，或者在新的流動相中濃度小甚至為零。A流動相含有胺改良劑；B流動相含有離子對試劑；矽膠柱；流動相中有四氫呋喃。可考慮採用專用柱用於特殊的方法，不用時將柱折下來，注滿適當的溶劑或流動相，密封保管，不再作其它的分析。

31.用內標法實驗時對內標物的要求有哪些？

A內標物的結構或理化性質應與被分析組分相似或相近；B內標物的保留值應稍大於或小於被分析物的保留，不能相差過大；C內標物的峰要與所有被分析物的峰有良好的分離度（R大於1。5），不能讓內標物成了干擾物；D無結構相似的內標物，可用保留相近的內標物；E儀器對分析物的響應與內標基本一致，出峰面積大小不能相差懸殊。

32.管子切割與安裝注意事項？

A管子的斷面必須垂直，否則，將會產生死體積而引起色譜峰峰形擴充套件。B確保管子內表面不被損傷，如果損傷，可能會發生管路堵塞。C將管子完全插入開口端，直至其與開口端的末端相碰為止。否則，將會產生死體積而引起色譜峰峰形擴充套件。D不要過分擰緊螺帽，以防損壞螺紋。

33. 什麼是HPLC的“無限直徑效應”？

在HPLC分析中由於使用了高效微粒固定相及高壓流動相，樣品以柱塞式注入色譜柱後，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴散很小，直至它從色譜柱流出也未與色譜柱內壁接觸，因而引起的色譜峰形擴充套件很小，能保持高柱效。

34.如何評價一臺檢測器？

A噪聲：通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動、電壓的線性脈衝以及其他非溶質作用產生的高頻噪聲和基線的無規則波動；

B基線飄移：漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動，可在較長時間（0。5~1h）內觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個液相色譜系統有關，而不僅是由檢測器引起的；

C靈敏度（最小檢出濃度或最小檢出量）：在一個特定分離工作中， 檢測器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當比較檢測器時，常使用敏感度這一效能指標。敏感度即指訊號與噪聲的比值（信噪比）等於2時，在單位時間內進入檢測器的溶質的濃度或質量；

D線性範圍：在進行定量分析時，希望檢測器有寬的線性範圍，以便在一次分析中可同時對主要組分和痕量組分同時進行檢測；

E檢測器的池體積：它應小於最早流出的死時間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會產生嚴重的柱外譜帶擴充套件。

35.如何簡單判斷比例閥是否內漏？

設定泵使用一個單獨通路（A），開啟Purge閥，流速5ml/min，提起其他溶劑瓶內的溶劑過濾頭直至離開液麵，觀察這些通路（B、C、D）內的溶劑是否隨著流動，正常時均不應流動。

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