體外診斷試劑參考區間確定註冊審查指導原則

本指導原則旨在指導醫療器械註冊申請人對註冊申報資料中參考區間研究資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評註冊申報資料提供參考。

本指導原則是對體外診斷試劑參考區間確定的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，並依據產品的具體特性對註冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供

醫療器械註冊

申請人和技術審評人員使用的指導檔案，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以採用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導原則是在現行法規、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規、標準體系的不斷完善和科學技術的不斷髮展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、適用範圍

本指導原則適用於定量檢測體外診斷試劑參考區間的確定研究。本文主要討論健康人群相關的參考區間，申請人也可用類似方法建立其他型別參考人群的參考區間，如其他特定生理或病理條件的參考區間。

本指導原則不適用於定性和半定量檢測試劑；不適用於藥物濃度監測用途的檢測試劑；不適用於致病性病原體相關檢測試劑；不適用於醫學決定水平的確定。已經有國內公認、統一的參考區間和醫學決定水平的檢測專案，可不再建立參考區間，此類產品應將評估重點放在標準化方面。

本指導原則適用於進行相關產品註冊和變更註冊的體外診斷試劑參考區間確定，包括申報資料中的部分要求，其他未盡事宜，應當符合《體外診斷試劑註冊與備案管理辦法》（國家市場監督管理總局令48號）（以下簡稱《辦法》）等相關法規要求。

二、基本原則

應按照以下情況，分別選擇建立和驗證的方式確定申報產品的參考區間：

1。首個申報產品（境內無同類已批准上市註冊產品）

1。1境內申報產品應透過建立的方法，確定申報產品的參考區間。

1。2進口申報產品，如在境外申請人註冊地或者生產地所在國家（地區）已批准上市，申請人需驗證申報產品說明書載明的參考區間的適用性。如驗證不透過，需建立適用於中國人群的參考區間。未在境外申請人註冊地或生產地所在國家（地區）上市的創新醫療器械，應建立包含中國人群參考區間。

2。國內已有同類產品批准上市的申報產品，可選擇自行建立參考區間，也可以選擇驗證該產品境外註冊試劑說明書中的參考區間（進口註冊適用），或其他國內已註冊產品參考區間，但應首選註冊申報中臨床試驗或臨床評價中方法學比對時，所選擇的對比試劑的參考區間進行驗證。如驗證透過，可直接採用經驗證的參考區間；如驗證不透過，應建立參考區間。

上述參考區間的驗證應滿足下文“（二）參考區間的驗證”章節相關條件；參考區間的建立應滿足下文“（一）參考區間的建立”章節相關要求。

三、技術審查要點

（一）參考區間的建立

1。參考樣本組的選擇

1。1制定參考個體的選擇標準

篩選參考個體時，應首先確定檢測專案的適用人群，除成年表觀健康人外，適用時，也應考慮納入未成年人（如評估生長髮育的指標）或老年人（如評估衰老相關疾病的指標），絕經前和絕經後表觀健康女性個體（如部分女性相關腫瘤標誌物、骨代謝標誌物等），不同月經週期女性（如性激素）等；對於特定體液樣本型別，如腦脊液，可考慮將非相關病理人群的特定評估指標作為參考個體的篩選標準。應根據申報產品個性化定義“表觀健康”，評估可能的生理及病理影響因素，據此設定明確的納入、排除標準。應依據納入、排除標準設計參考個體調查問卷，並採取必要的措施保證問卷填寫的準確、客觀。

綜上，針對不同檢測專案參考個體的排除標準也不盡相同，表1中列出應予以考慮的部分排除因素，申請人應根據檢測專案的不同，增加或減少排除標準。

表1 參考個體選擇應考慮的排除因素

1。2制定參考個體的分組標準

根據所篩選參考個體的特徵，考慮其是否對臨床決策具有意義等情況，對其進行分組。研究者應根據檢測專案的不同，合理設計分組條件。潛在分組條件可以是年齡、性別、血型、種族、晝夜節律、飲食、吸菸、運動、月經週期、妊娠階段、取樣時間、地理位置、職業等因素。

1。3 參考個體的選擇

參考個體選擇時，應按照明確的標準採用直接抽樣的方式進行選擇。參考個體應儘可能接近檢測專案的臨床患者分佈組成，儘可能涵蓋各年齡組內不同年齡段，且男女個體數量應相當（適用時），地域選擇應具有代表性。參考個體分佈特徵應儘量接近社群人群分佈。註冊申請人根據產品特點設計納入、排除標準，將符合標準的具有人群代表性的個體納入參考人群。建議透過多中心招募的形式納入參考人群。

2。樣本採集與處理

2。1參考個體準備

參考個體的狀態指對檢測專案結果具有影響的狀態。樣本採集前進食會對許多檢測專案有直接（濃度改變）或間接（脂類物質干擾）的影響，長期節食也會造成許多檢測指標的改變。另外，咖啡因、酒精、香菸和維生素C等，也會對許多檢測專案的檢測結果產生影響。因此，應該對參考個體各項可能產生影響的因素（表2）進行評價，保證狀態良好方可進行樣本的採集。

表2 參考個體的狀態因素

2。2樣本的採集、處理和儲存

影響參考樣本採集、處理和儲存的因素包括取樣環境、取樣時間、取樣體位、樣本型別、運送方式、樣本狀態、樣本分離、儲存方式等。申請人應採用符合說明書聲稱要求的樣本進行參考區間研究，並在研究報告中詳細說明樣本型別、儲存方式等情況。如檢測採用血液樣本，應區分動脈血、靜脈血及毛細血管血；如需使用抗凝劑，需明確抗凝劑的型別；如採集尿液樣本應明確取樣時間段（如適用）。

3。樣本檢測

應採用檢測系統進行參考樣本的檢測。檢測系統包括樣本處理用產品、檢測試劑、校準品、質控品、檢測裝置等。

4。資料分析

依據臨床意義的不同，參考區間研究需要確定檢測專案的單側界值或雙側界值。通常使用雙側2。5%～97。5%人群分佈，單側時可選擇95%或5%。

4。1參考樣本數量

研究至少需要120例參考樣本，此時可對參考限的90%置信區間進行準確估計。參考限的置信區間不同，所需參考樣本量也不盡相同，具體見表3。如需分組評估，則每組均需要滿足相應置信區間的參考樣本量要求。如有離群值，則應在剔除離群值後補足相應參考樣本例數。

表3 95%參考區間的不同置信區間最少樣本數量

4。2繪製分佈圖

繪製分佈圖用以瞭解資料分佈特徵，並對資料進行審查。

為了解資料的分佈特性，需對資料是否呈正態分佈進行判斷，即資料對稱性和正態峰的判斷。資料對稱性和正態峰的判斷可透過直方圖、正態機率圖，或採用假設檢驗的方法進行綜合判斷，常用的假設檢驗方法有矩法、W檢驗法、KS檢驗法等。

4。3資料離群值的判斷

申請人應採用合理的統計分析方法進行離群值的判定。此處推薦兩種方法：

4。3。1 Dixon方法（適用於非正態分佈資料）

4。3。1。1在參考值檢測資料中，如果有疑似離群資料，應將疑似離群值的檢測結果和其相鄰值的差D和資料（包含疑似離群值）全距R相除，若D/R≥1/3考慮為離群值。

4。3。1。2若同側有2個或以上疑似離群點，可從最小的疑似離群點起作如上處理，若D/R都大於1/3，則所有疑似點都定義為離群值；若D/R都小於1/3，則保留所有疑似資料。

4。3。2 Tukey法（適用於正態分佈資料）

4。3。2。1 計算資料集的四分位數，定義為Q3（75%分位數）和Q1（25%分位數）。計算四分位間距，定義為IQR（Q3-Q1）。將大於四分位間距上限：Q3+1。5×IQR或小於四分位間距下限：Q1-1。5×IQR的參考值定義為離群值。

4。3。3如出現離群值，應對離群值產生原因進行分析，如果有明確的原因，如檢測時操作錯誤等，可將離群值剔除，如無明確原因，應將該資料保留。

4。4資料分組

資料是否需要分組，需根據參考區間分組是否對臨床決策具有意義或檢測專案具有明確的生理學意義，且必須對不同亞組之間的差別進行統計學假設檢驗，檢驗結果應顯示差異有統計學意義。

申請人應結合資料分佈特徵選擇適當的統計假設方法進行資料分組判定。如資料呈正態分佈，申請人可採用Z檢驗，確定分組後的均值間差異有無統計上的顯著性。

式中，

1——第一組參考值的均值

2——第二組參考值的均值

s1 ——第一組參考值的標準差

s2 ——第二組參考值的標準差

n1——第一組參考值的數量

n2 ——第二組參考值的數量

n——平均樣本量

如s2＞1。5s1或s2/（s2-s1）＜3時，可以考慮分組；如計算Z值超過Z*時，也可考慮成分組。

4。5建立參考區間

依據資料分佈特徵，計算參考區間的常用方法包括引數法和非引數法。

4。5。1經正態性檢驗後，如參考值資料近似正態分佈或檢測資料經變數轉換後呈正態分佈，可採用正態分佈法確定參考區間，樣本量要求見表3。用該方法確定的參考區間所得結果穩定，受兩端資料影響較小。

可採用下述公式進行參考區間的計算：

雙側1-α參考區間：`X±Z1-α/2S

單側1-α參考區間：＞`X -Z1-αS或＜`X＋Z1-αS

式中`X為均數，S為標準差。

4。5。2經正態性檢驗後，如參考值資料呈偏態分佈，可採用百分位數法（非引數法）確定參考區間，樣本量要求見表3。該方法受兩端資料影響較大，樣本含量較小時結果不穩定、不宜選用。將n個參考個體檢測值按照從小到大的順序排列，並依次編上秩次。把n個秩次分為100等分，與r%秩次對應的數稱為第r百分位數，用Pr表示。分別計算參考值下限r1（2。5百分位數）和參考值上限r2（97。5百分位數）作為檢測專案的95%參考區間。還需計算參考限的90%或95%置信區間。若r值計算值不是整數，可將它們四捨五入後取整。

（二）參考區間的驗證

1。驗證條件

採用驗證的方法確定申報試劑參考區間時，需要滿足以下條件：第一，原始參考區間的研究應系統全面，具有可信性，如已釋出實施的臨床檢測參考區間標準等；第二，檢測系統需具有可比性；第三，參考區間研究的分析前因素需具有可比性，如參考個體的狀態，標本採集和處理程式等； 第四，參考人群的適宜性。原始參考區間研究所採用的參考人群應在人群分佈的地理位置、人口統計學特徵等方面與申報試劑預期適用人群相一致，或包含符合參考區間建立參考樣本數量要求的上述參考人群。如不能同時滿足上述條件，申請人需按照前文所述方法建立自己的參考區間。

申請人應透過方法學比對的方法，對申報產品與原始參考區間建立時的檢測系統的可比性進行研究。方法學比對研究方法，可參考《免於臨床試驗的體外診斷試劑臨床評價技術指導原則》（國家藥品監督管理局2021第74號公告）。注意兩檢測系統檢測結果應具有高度一致性。申請人應透過列表的方式，對比參考人群分佈的地理位置、生物特徵、參考區間研究分析前的因素等。

2。參考區間的驗證

申請人應選擇至少20例與申報產品預期使用人群地理分佈和人口統計學特徵相似的參考個體，在具有與原始參考區間研究一致的分析前因素和相同的檢測條件下，研究小樣本人群的參考值。比較小樣本參考值和原始參考區間之間的可比性。如果20例參考個體中只有不超過2例的參考值超出原始參考區間，即透過驗證，可以直接使用原始參考區間。如參考個體多於20例，則超出原始參考區間的資料不超過檢測結果的10%，即透過驗證；若有10%以上的資料超出原始參考區間，則應另選至少20例參考個體，重新按照上述判斷標準進行驗證。若參考區間驗證使用了其他參考界值，則對應的驗證標準需滿足統計學要求的。若驗證結果符合要求，可直接使用原始參考區間，反之則應檢查所有的分析程式，考慮樣本是否有生物學差異，並按照前文所述方法建立自己的參考區間。

在統計學上，隨著樣本量的增加，利用統計原理髮現人群差異的能力更強。因此，申請人可以加大參考個體的樣本量，如採用60例樣本，並將測得的參考值與原始參考區間比較，判斷參考值和原始參考區間之間是否具有可比性。

（三）說明書

申請人應在說明書【參考區間】中載明經研究確定的參考區間。此部分內容應包含參考區間確定的基本資訊，包括：樣本量、參考人群特徵（如性別、年齡、種族等）和參考區間確定採用的統計學方法。

四、其他應注意的問題

無論是建立自己的參考區間或驗證參考區間，都要確保參考區間的可溯源性，記錄確定參考區間的所有步驟，包括參考個體的選擇、分析前因素、樣本檢測以及統計分析方法等。

五、名詞解釋

1。參考個體（reference individual）：根據明確標準選擇出進行實驗的個體。通常是符合特定標準的健康個體。

2。 參考人群（reference population）：由所有參考個體組成的群體。

注：通常情況下參考人群中的個體數是未知的，因此參考人群是一個假設實體。

3。參考樣本組（reference sample group）：從參考人群中選出的用以代表參考人群的足夠數量的個體。

4。參考值（reference value）：透過對參考個體某一特定量進行觀察或測量而得到的值（檢驗結果）。

5。參考分佈（reference distribution）：一組參考值的分佈。

6。參考限（reference limit）：源自參考值的分佈，用於描述部分參考值的位置（小於或等於、大於或等於、上限/下限）。

7。參考區間（reference interval）：來自生物參考人群的數值的特定分佈區間。

注：在有些情況下，只有一端的生物學參考界限是重要的，通常是上限“x”，相應的參考區間將是小於或等於“x”。

六、參考文獻

［1］ GB/T 29791。1-2013，體外診斷醫療器械製造商提供的資訊（標示）第1部分：術語、定義和通用要求［S］。

［2］ CLSI。 Defining， Establishing， and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory； Approved Guideline—Third Edition。 CLSI document EP28-A3c。 Wayne， PA： Clinical and Laboratory Standards Institute； 2010。

［3］ WS/T 402-2012，臨床實驗室檢驗專案參考區間的制定［S］。

［4］ WS/T 780-2021，兒童臨床常用生化檢驗專案參考區間［S］。