公眾號：生信小課堂

影響因子：

6。53

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研究背景：

結直腸癌（CRC）是胃腸道系統的惡性腫瘤。CRC常轉移擴散至肝、肺、骨和卵巢等器官，極大影響了患者的生存率。目前分子靶向治療已成為治療CRC的熱點，因此，尋找新的生物標誌物對CRC的分子靶向治療至關重要。

縫隙連線作為維持細胞間聯絡的主要途徑之一，被認為是腫瘤轉移的潛在調節因子之一。

縫隙連線蛋白（連線蛋白）是能促進縫隙連線細胞間通訊

（GJIC）

。眾所周知，連線蛋白通常被認為是腫瘤抑制劑，然而，在轉移性病變中，它們可能具有介導促進癌細胞遷移和粘附的作用。到目前為止，關於連線蛋白在結直腸癌中的作用的研究仍然非常少。本研究將填補這一空白。

研究結果

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一、21種連線蛋白的遺傳特徵和轉錄變異研究

1、首先作者展示了連線蛋白的分子調控機制及其在腫瘤/非腫瘤細胞中潛在的重要調控作用（圖1A），並展示了21種連線蛋白間的相互作用關係（圖1B）。在CRC組織中，大多數連線蛋白激活了EMT訊號通路，但抑制了細胞週期和DNA損傷反應（圖1C）。

2、篩選CRC和正常組織中差異表達的連線蛋白（圖1D），進一步分析發現遺傳變異（CNVs）和DNA甲基化是影響連線蛋白表達水平的重要因素（圖1E），也是影響CRC患者預後的重要因素（圖1F）。

3、在TCGA資料庫中，部分連線蛋白之間存在顯著的共表達關係（圖1G）

4、CRC組織中連線蛋白的突變頻率為17。65%。提示，連線蛋白的失衡可導致結直腸癌的發生發展。

二、結直腸癌連線蛋白分子團簇的鑑定與分析

為了鑑定潛在的連線蛋白分子團簇，使用共識聚類分析對CRC樣本進行分析

1、CRC患者可被分為C1、C2兩個聚類（圖2A-C）；PCA結果顯示該分類可有效區分兩組CRC患者（圖2D）。

2、Kaplan-Meier生存分析顯示C1患者的OS、DFS和PFS相對於C2患者更差（圖2E-G），圖2H顯示了連線蛋白表達譜，以及臨床病理引數的分佈與病理分期之間的相關性。

3、分析顯示趨化因子、白細胞介素等免疫指標在C1簇中的表達高於C2簇（圖2I）。TCGA病理切片也證實C1組患者CRC組織中免疫細胞浸潤較C2組多（圖2J）。基於TCGA-編碼演算法顯示C1簇患者具有更多的M2巨噬細胞浸潤（圖2K）。

三、兩叢集間的功能差異分析

1、首先鑑定了CRC中突變頻率最高的基因（圖3A），比較了這20個基因在兩個聚類之間的突變頻率差異（圖3B），並探討了連線蛋白不同亞型之間的基因表達差異及其相關訊號通路的特徵（圖3C），透過CRC基因表達譜分析，共篩選出305個DEGs（圖3D）。

2、利用DEGs的PPI分析確定了10個樞紐基因，這些基因對CRC EMT有很強的啟用作用（圖3E-F）。GSEA顯示，EMT、血管生成和巨噬細胞活化在C1簇中被顯著啟用（圖3G）。

3、LASSO分析擬合方法示意圖（圖3H），透過序列Cox迴歸顯示GJA3、GJA4、GJB6與CRC預後顯著相關（圖3I）。

4、基於兩個獨立資料集的計算結果顯示，GJA4在CRC組織中過表達，在C1簇中顯著高表達，並且與免疫細胞浸潤的程度顯著相關（圖3J-L）。

四、GJA4的臨床分析

1、HPA資料庫分析顯示，GJA4在CRC組織中的蛋白水平上顯著高表達（圖4A和B）。CRC組織樣本免疫組化結果顯示，GJA4在CRC組織中的表達水平顯著高於癌旁組織（圖4G和H）。

2、根據結腸息肉存在、淋巴浸潤和樣本型別進行分類的病例中，GJA4的表達模式存在差異（圖4C和D）。

3、GJA4的表達水平與病理分期和T分期相關（圖4E）。Kaplan-Meier生存曲線顯示GJA4表達水平較高的患者PFI和疾病特異性生存期（DSS）較短（圖4F）。

五、GJA4的單細胞水平分析

1、在正常的腸上皮細胞中，GJA4主要在腸內分泌細胞上表達（圖5A）。但在CRC組織中GJA4主要在成纖維細胞上表達，但在CRC細胞上不表達（圖5B）。

2、TIMER資料庫結果顯示GJA4的表達水平與成纖維細胞的丰度高度正相關（圖5C和D）。並且在獨立樣本中發現GJA4與成纖維細胞標誌物表達一致（圖5E-G）。CRC標本的IF染色證實了GJA4和ACTA2的共表達模式在正常腸上皮上未見（圖5H）（圖5I）。

六、GJA4的免疫微環境分析

1、透過資料集分析發現，GJA4與腫瘤純度呈負相關（圖6A）。

2、細胞間通訊分析發現成纖維細胞、髓系細胞和惡性細胞之間複雜的相互作用（圖6B）。而細胞通訊在基質細胞發育過程中示意圖如圖6C。

3、M2巨噬細胞的浸潤程度與GJA4水平呈正相關（圖6D和E），IHC染色證實了這一點（圖6F）。

研究總結：

本研究從GEO和TCGA資料庫中獲得了合成連線蛋白編碼的基因表達資料。使用R語言等資料庫探索連線蛋白可能的生物學機制。採用免疫熒光和免疫組化等方法驗證連線蛋白-GJA4的表達及定位。本研究有助於增強對腫瘤微環境（TME）的理解，並可能指導更有效的免疫治療策略。