公眾號：生信小課堂

影響因子：

8。7

研究概述

肺癌是全球癌症相關死亡的主要原因，其中肺腺癌（LUAD）是肺癌最主要的組織學亞型，其5年總生存期（OS）低於20%。近年來，免疫療法的臨床應用顯著提高了LUAD的臨床療效。自然殺傷（NK）細胞是先天免疫細胞的一種亞型，可以快速識別並殺死腫瘤細胞。同時，NK細胞還可以透過直接殺死腫瘤細胞和促進適應性T細胞免疫反應，在腫瘤早期參與抗腫瘤免疫，從而限制腫瘤細胞的侵襲性，降低惡性腫瘤的風險。

在這項研究中，作者首先對LUAD的scRNA-seq進行了全面分析，以剖析腫瘤浸潤NK細胞的分子特徵並識別標記基因。隨後，作者構建了一個NK細胞標記基因特徵（NKCMGS），並分析該特徵與LUAD預後和免疫治療反應之間的關係。

流程圖：

研究結果

一、識別NK細胞標記基因

1、基於GSE131907的scRNA-seq資料，從11個LUAD樣本中獲得了45149個細胞的基因表達譜，用於進一步分析（下圖A）。

2、使用前1500個可變基因進行主成分分析，鑑定出17個細胞叢集（下圖B）。隨後，對每個叢集的細胞進行註釋，鑑定出NK細胞（下圖C），其中有189個基因存在差異表達（下圖D），被鑑定為與LUAD相關的NK細胞標記基因。

二、基於NK細胞標記基因的七基因預後特徵的建立

1、使用Cox迴歸和LASSO迴歸分析篩選出7個基因構建LUAD預後特徵（NKCMGS）。利用風險評分中位值將患者分為低風險和高風險組。下圖A顯示風險評分和生存狀態的分佈，可以看出高風險組的死亡人數更多。下圖B則顯示7個NK細胞標記基因的表達情況。

2、Kaplan-Meier分析表明，高風險評分患者的OS顯著低於低風險評分患者（下圖C）。ROC曲線下面積，1年、3年和5年的AUC值分別為0。710、0。725和0。730（下圖D）。

三、驗證NKCMGS在不同佇列中的預後效能

1、納入6個獨立的GEO佇列，這6個GEO佇列的臨床特徵如下表1所示。計算6個GEO佇列中每位患者的風險評分，根據中位風險評分將患者分為高風險組和低風險組。

2、Kaplan-Meier分析表明，在所有6個GEO佇列中，高風險組的預後均低於低風險組。GSE30219（下圖A），GSE3141（下圖B），GSE50081（下圖C），GSE26939（下圖D），GSE72094（下圖E）和GSE31210（下圖F）。

3、6個GEO佇列中風險評分的ROC曲線也顯示出良好的效能，可見NKCMGS是LUAD患者的重要預後指標（下圖G）。

四、NKCMGS對LUAD患者的獨立預後作用

1、使用TCGA資料庫中LUAD患者的臨床特徵、分子因素和風險評分進行單變數和多變數Cox迴歸分析。多變數Cox迴歸分析結果證明，NKCMGS的風險評分是一個獨立的預後因素（下表2）。

2、對風險評分和所有臨床特徵進行LASSO迴歸分析。結果表明，風險評分和腫瘤分期是LUAD預後的最佳預測因素。

五、NKCMGS相關基因的功能富集分析

1、為了闡明NKCMGS預測能力的潛在機制，作者研究了與NKCMGS相關的生物學途徑（下圖A）。GO分析顯示這些基因主要涉及有絲分裂和有絲分裂細胞週期的G2/M期調控（下圖B）。KEGG分析證實這些基因與細胞週期途徑密切相關（下圖C）。

六、NKCMGS與免疫細胞浸潤

1、使用ESTIMATE演算法，發現高風險患者的免疫評分、基質評分、綜合評分和腫瘤純度均高於低風險患者（下圖A-D），這表明風險評分與免疫細胞浸潤水平密切相關。

2、CIBERSORT分析顯示，高風險患者中的靜息NK細胞、M0巨噬細胞、M2巨噬細胞、活化的樹突細胞和肥大細胞比例較高，但漿細胞、CD8+T細胞、濾泡輔助T細胞、調節性T細胞、靜息樹突細胞和靜息肥大細胞的比例較低（下圖E）。

3、下圖F顯示高風險組和低風險組之間不同免疫細胞的比例。作者進一步進行風險評分與免疫細胞浸潤之間的相關性分析。結果表明，風險評分與巨噬細胞和中性粒細胞呈正相關，但與T細胞、B細胞和肥大細胞呈負相關。

七、NKCMGS可以預測LUAD患者的免疫治療反應

1、分析TCGA資料庫LUAD佇列中NKCMGS與免疫治療生物標誌物（PD-L1表達和TMB）之間的關係。結果表明，PD-L1表達在低風險和高風險患者之間沒有顯著差異，但低風險患者的TMB明顯低於高風險患者（下圖A-B）。此外，作者還發現低風險患者的T細胞受體（TCR）豐富度和多樣性顯著高於高風險患者（下圖C-D）。

1、研究招募了298名IMvigor210佇列中接受抗PD-L1治療的患者進行分析。Kaplan-Meier分析顯示免疫治療後高風險患者的生存率較低（下圖E）。低風險評分與對抗PD-L1治療的客觀反應相關（下圖F）。低風險組抗PD-L1治療的客觀緩解率顯著升高（下圖G）。

3、ROC曲線顯示，TMB、PD-L1和風險評分模型聯合預測抗PD-L1反應的準確率為76。1%，優於TMB（AUC=0。728）、PD-L1（AUC=0。569）或單獨的風險評分（AUC=0。603）（下圖H）。這些發現表明低風險評分的患者更有可能從免疫治療中受益，而NKCMGS可能是識別從免疫治療中受益的LUAD患者的生物標誌物。

總結

作者基於TCGA和GEO佇列中的NK細胞標記基因開發了一種七基因預後特徵（NKCMGS），該特徵的預測能力在不同的臨床亞組和佇列中得到了驗證。最終結果顯示，NKCMGS具有預測LUAD患者預後和免疫治療反應的強大效能，可以作為關於LUAD個體化預測及臨床決策的預後生物標誌物，並有助於選擇可以從免疫治療中受益的合適患者。